Определение концентрации нуклеиновых кислот и чистоты препарата

Метод определения концентрации нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) в растворе основан на существовании у ДНК и РНК максимума поглощения при длине волны 260 нм. Это означает, что в растворах нуклеиновых кислот максимальная фотометрическая абсорбция наблюдается при 260 нм и прямо коррелирует с концентрацией ДНК или РНК.

Определение чистоты препарата ДНК или РНК

Отношение поглощения при длинах волн 260 нм и 280 нм (260нм/280нм) показывает чистоту препарата ДНК или РНК. Препарат считается чистым, если отношение значений 260нм/280нм приблизительно равно 1.8 для ДНК и 2.8 для РНК. В случае меньших значений показателя 260нм/280нм препарат содержит большое количество примесей белка, фенола или иных контаминирующих агентов, имеющих значительное поглощение при 280 нм.

Другим показателем чистоты препарата ДНК или РНК является отношение значений поглощения 260нм/230нм. В случае чистого препарата это соотношение обычно равно 1.8 – 2.2. Меньшие значения коэффициента 260нм/230нм свидетельствуют о загрязнении препарата компонентами, которые остаются после процедуры выделения ДНК или РНК.

При постановке измерения образец ДНК разбавляют дистиллированной водой в 40 раз (к 5 мкл раствора ДНК добавляют 195 мкл воды). Измерение поглощения при 260 нм проводят в кювете с длиной оптического пути 1 мм, используя воду в качестве референса. Значение концентрации ДНК в исходном растворе (мкг/мкл) находят, умножая значение поглощения при длине волны 260 нм на К=20.

РНК разбавляют водой в 10 раз (к 20 мкл раствора ДНК добавляют 180 мкл воды). Измерение поглощения при 260 нм проводят в кювете с длиной оптического пути 1 мм, используя воду в качестве референса. Значение концентрации РНК в исходном растворе (мкг/мкл) находят, умножая значение поглощения при длине волны 260 нм на К=4.