|
А.И.Андреев, С.В.Мухин, В.В.Некрасов, В.А.Никитенко, А.В.Пауткина
Модульная многофункциональная оптоволоконная спектрометрическая система
Часть I
Устройство и принципы эксплуатации аппаратуры
1.6.2. Измерение спектров отражения, пропускания, прозрачности, люминесценции и возбуждения излучения
Наука о методах фотометрирования потоков оптического излучения в зависимости от длины волны называется спектрофотометрией. Она включает в себя фотометрию, спектрометрию и метрологию.
Измерения таких фотометрических параметров как коэффициент направленного пропускания или зеркального отражения относительно просты и основаны на том, что в пучок падающего излучения вводят образец, и относят поток, прошедший через него (или соответственно отражённый от него), к падающему потоку при отсутствии образца.
При диффузном отражении или пропускании необходимо собрать все лучи, рассеянные по разным направлениям. В этом случае для измерения коэффициентов пропускания и отражения часто применяют интегрирующий фотометрический шар, имеющий диффузно отражающую белую внутреннюю поверхность.
Подобные шары используют и для измерения светового потока от источника излучения (источник излучения помещают внутрь шара). Идея эксперимента заключается в том, что освещённость, создаваемая многократными отражениями внутри шара, равномерно распределяется по его внутренней поверхности и прямо пропорциональна полному световому потоку. Если какую-либо точку внутренней поверхности шара защитить от прямого попадания лучей от источника, то её освещённость будет прямо пропорциональна его полному световому потоку. Проводя поочерёдно измерения с эталонным и исследуемым образцом по отношению полученных освещённостей можно рассчитать световой поток от образцового источника.
Спектрометрия включает в себя разнообразные спектральные приборы, являющиеся составной частью спектрофотометра.
В целом в состав спектрофотометра входят: источник оптического излучения, устройство для выделения необходимых спектральных интервалов (монохроматор или набор светофильтров), фотоприемник, и система регистрации сигнала. Система регистрации может быть одноканальной (обычно строится на базе монохроматора, в котором сканирование осуществляется поворотом дифракционной решетки или призмы) или многоканальной (сканирование не применяется, а дискретный ряд длин волн в полихроматорах или участки непрерывного спектра в спектрографах регистрируются одновременно). Во всех современных серийных спектрофотометрах монохроматор располагают между источником света и образцом, чтобы свести к минимуму фотохимическое действие зондирующего излучения.
При измерении спектров поглощения обычно получают кривые, на которых по оси абсцисс откладывается длина волны или волновое число, а по оси ординат - прозрачность или оптическая плотность.
Одним из важных факторов устранения ошибок при спектрофотометрических измерениях является выбор диапазона значений измеряемого сигнала. Поскольку для определения прозрачности, оптической плотности или пропускания сравниваются два сигнала, важно, чтобы их разность значительно превышала уровень шумов.
Для корректного определения величин D и T очень важно учитывать влияние отраженного и рассеянного образцом и элементами аппаратуры света. На приемник кроме излучения измеряемой длины волны всегда, в той или иной мере, попадает отраженное или рассеянное оптическими деталями прибора излучение других длин волн (как правило из максимума излучения источника света). Минимальным уровнем рассеянного света обладают спектрофотометры, оборудованные двойными монохроматорами, особенно с комбинированным призменно-решеточным диспергирующим устройством (типа Shimadzu mod. UV-365). Однако не следует обольщаться высокими паспортными возможностями приборов (самые современные характеризуются диапазоном оптических плотностей вплоть до D=5). Если не приняты все меры для сведения к минимуму влияния побочного (рассеянного) света, пропущенного монохроматором на тех длинах волн, где исследуемый объект не поглощает, то измеренные значения оптической плотности и прозрачности могут оказаться очень далеки от истинных.
Доля рассеянного света (i) становится особенно большой в той спектральной области измерений, где мала чувствительность фотоприемника или яркость источника и наиболее сильно проявляется при регистрации интенсивных полос поглощения. При этом измеряемая оптическая плотность DBreg Bоказывается меньше истинной D:
 а  . (1.6.1)
Рассеяние света в объеме и на поверхности исследуемых образцов, а также их фотолюминесценция, вносят дополнительные искажения в наблюдаемые спектры поглощения. Рассеяние света образцом приводит к искажению формы спектров и к неверному определению величины оптической плотности.
Измерение спектров люминесценции
Отличие флуоресцентной спектроскопии от других спектроскопических методик состоит в том, что регистрируемая спектральная зависимость является функцией двух переменных - длины волны возбуждения lBexB и длины волны испускания lBemB. Если lBexB поддерживается постоянной, а lBemB сканируется, то измеряется спектр флуоресценции I(lBemB) (спектральная зависимость интенсивности флуоресцентного испускания от длины волны). Если сканируется lBexB при постоянной lBemB, то получается спектр возбуждения флуоресценции I(lBexB) (спектральная зависимость эффективности возбуждения флуоресценции от длины волны). При графическом изображении спектров испускания (или возбуждения) флуоресценции по оси абсцисс откладывают длину волны (в нанометрах) или волновое число (в смP-1P), а по оси ординат - интенсивность флуоресценции IBfl B(в произвольных единицах). Если оптическое поглощение света достаточно мало, а спектральное распределение возбуждающего света учитывается корректно, спектр возбуждения будет близок по форме к спектру поглощения.
У жидких растворов индивидуальных органических молекул, как правило, форма спектра испускания флуоресценции не зависит от длины волны возбуждения. Форма полосы истинного спектра флуоресценции молекулярного раствора в большинстве случаев зеркально симметрична наиболее длинноволновой полосе поглощения. Как правило эти полосы перекрывются друг с другом в некотором спектральном диапазоне.
При возбуждении в самый длинноволновый край спектра поглощения, спектры флуоресценции твердых молекулярных растворов испытывают смещение.
Для исследования спектрального распределения света, испускаемого образцом, предназначены спектрофлуориметры. На этих приборах можно также измерять изменения интенсивности испускания в зависимости от длины волны возбуждения (спектры возбуждения флуоресценции).
Спектрофлуориметр состоит из следующих основных устройств: источника возбуждающего света; устройств для выделения спектральных интервалов возбуждения люминесценции и ее регистрации (в наиболее универсальных приборах это монохроматоры); фотоприемника с электронной системой регистрации сигнала.
Пропускание монохроматоров и чувствительность фотоприемников зависят от длины волны. Поэтому, для получения истинного относительного распределения интенсивностей в спектрах флуоресценции, измеренные зависимости тока фотоприемника от длины волны должны быть скорректированы на калибровочную функцию (спектральная чувствительность прибора). В противном случае измеренные спектральные распределения не будут соответствовать истинным спектрам флуоресценции. В большинстве современных спектрофлуориметров исправление спектров происходит автоматически. Спектры, полученные на разных приборах, ни в коем случае нельзя сопоставлять, если нет уверенности, что они скорректированы на спектральную чувствительность аппаратуры.
Особенностью спектрофлуориметрии является то, что флуоресцентное излучение возникает во внутреннем объеме образца и изотропно распространяется по всем направлениям (в полном телесном угле 4p). Условия сбора этого излучения на фотоприемник и геометрическая форма образцов сильно сказываются на интенсивности регистрируемых спектров флуоресценции. Нарушение условий изотропности в оптическом тракте или образце могут привести к изменению их спектральной формы.
Флуоресценция крайне чувствительный метод. Поэтому сильные искажения спектров могут быть вызваны рассеянием света в образце и (или) присутствием в нем даже незначительных количеств примесей. Примеси могут приводить как к искажению истинных спектральных зависимостей вкладом своей люминесценции, так и к уменьшению интенсивности свечения вплоть до полного тушения. Какая-либо компенсация этих эффектов или их учет по измерениям эталонных образцов, не содержащих исследуемого люминесцирующего соединения невозможны.
Даже в условиях полного отсутствия искажающих факторов, экспериментально измеренные спектральные зависимости далеко не всегда соответствуют истинным спектрам флуоресценции. Их интенсивность может зависеть от геометрической схемы регистрации флуоресценции по отношению к направлению возбуждающего светового пучка.
Если оптическая плотность исследуемого образца мала (D<0,1), то интенсивность флуоресценции одинакова в любой точке вдоль пути возбуждающего света через образец. При увеличении оптической поглощательной способности образца интенсивность флуоресценции, регистрируемой под прямым углом, вначале растет, затем ее рост постепенно замедляется и, наконец, падает, поскольку флуоресценция почти перестаёт проходить сквозь основной объем образца. При этом флуоресцирует лишь часть образца, прилегающая к поверхности на которую падает возбуждающее излучение. Регистрация флуоресценции с этой поверхности (регистрация "на отражение") позволяет проводить измерения и в таких условиях. При регистрации "на отражение" наблюдается насыщение роста интенсивности флуоресценции с ростом концентрации флуоресцирующих молекул.
Такое поведение флуоресценции, наряду с геометрией эксперимента, обусловлено двумя эффектами: поглощением возбуждающего света и света собственной флуоресценции в объеме образца. Первый эффект называют эффектом внутреннего фильтра, а второй - реабсорбцией или вторичным поглощением. Обсудим их подробнее.
Эффект внутреннего фильтра наблюдается при высоких оптических плотностях и заключается в том, что интенсивность возбуждающего света в объеме образца удаленном от источника света меньше, чем в ближайшем к источнику объеме. Передние слои образца работают как фильтр, поглощающий большую часть возбуждающего света. Освещенность образца становится неравномерной, а интенсивность люминесценции уменьшается. При очень больших концентрациях возбуждающий свет поглощается практически полностью, и флуоресценция может наблюдаться только из тонкого приповерхностного слоя. Форма спектра флуоресценции может и не искажаться, если достаточно мала оптическая плотность в области перекрывания спектров поглощения и флуоресценции или перекрывание незначительно. Эффект внутреннего фильтра может быть вызван любыми поглощающими свет компонентами образца, включая растворитель (полимерную основу) и примеси. Искажения формы спектров флуоресценции за счет внутреннего фильтра будут наблюдаться, если поглощение этих компонент лежит в спектральной области исследуемой флуоресценции.
Если спектры поглощения и флуоресценции перекрываются и оптическая плотность образца в области перекрывания велика, то наблюдается поглощение света собственной флуоресценции самим флуоресцирующим компонентом - реабсорбция или вторичное поглощение. Эффект реабсорбции, наряду с уменьшением интенсивности флуоресценции, всегда приводит к искажению формы спектров. При этом нарушается зеркальная симметрия спектров поглощения и флуоресценции. Это обусловлено тем, что реабсорбция вызывает искажения формы спектра флуоресценции исключительно в области его перекрывания со спектром поглощения. В результате этих искажений постепенно, с ростом оптической плотности образца в этой области (например, за счет увеличения концентрации флуоресцирующего компонента), исчезает коротковолновая (для многих люминофоров обладающая разрешенной колебательной структурой) часть спектра флуоресценции. Искажения становятся тем больше, чем больше оптическая плотность флуоресцирующего компонента в области перекрывания спектров. В конечном счете, от истинного спектра флуоресценции остается лишь длинноволновый бесструктурный хвост, расположенный практически вне области собственного поглощения флуоресцирующего компонента. Спектральный максимум этого бесструктурного образования может оказаться на десятки нанометров смещенным относительно положения максимума истинного спектра.
Явление реабсорбции обусловлено как люминесцентными свойствами вещества, так и методическими особенностями измерения флуоресценции. Как уже упоминалось выше, квантовый выход люминесценции всегда меньше единицы и часть поглощенного молекулой света расходуется безызлучательно. Это означает, что с каждым актом вторичного поглощения кванта флуоресценции интенсивность последующего флуоресцентного излучения уменьшается. С другой стороны, в изотропной среде молекулы испускают флуоресценцию в полный телесный угол 4p. Тогда как технические возможности флуориметров позволяют собирать на фотоприемник свет в телесном угле с раствором 30P0P-40PоP, что составляет лишь около 10% полного испускания. Учитывая угол светосбора и тот факт, что каждая вторично поглотившая квант света люминесценции молекула переизлучает его в сферу с интегральной интенсивностью определяемой квантовым выходом, нетрудно видеть, что в каждом акте вторичного испускания регистрируемая интенсивность флуоресценции уменьшается более чем в десять раз.
Кажущиеся изменения формы спектров и спектральные сдвиги, обусловленные тривиальным эффектом реабсорбции, неискушенным исследователем вполне могут быть интерпретированы за счет структурных изменений в образце. Например, проявление реабсорбции может быть интерпретировано, как разгорание сенсибилизированной флуоресценции в результате переноса энергии с донора на акцептор или ошибочно отнесено к образованию эксимеров. Поэтому при измерениях флуоресценции всегда следует помнить, что искажения интенсивности и формы полос спектров флуоресценции пренебрежимо малы только в случаях, когда оптическая плотность образца в области перекрывания спектра поглощения флуоресцирующего компонента со спектром его испускания (можно назвать эту величину “оптической толщиной” образца) не превышает значений 0,01-0,05. При таких оптических плотностях практически не проявляется и эффект внутреннего фильтра. Требования к этому фактору для примесей не столь жесткие, если нужно измерить только форму спектров флуоресценции, а не их интенсивность, и поглощение примесей не попадает в полосу флуоресценции. В измерениях квантового выхода люминесценции учет примесного фактора необходим.
Как видим, корректное измерение спектров люминесценции возможно лишь при малых оптических плотностях. Подбор требуемой величины оптической плотности возможен за счет уменьшения концентрации люминесцирующей компоненты в образе или за счет уменьшения толщины слоя. Однако в последнем случае далеко не всегда удается устранить проявление реабсорбции. В тонких слоях растворов (толщиной 1мм) с оптической плотностью порядка 0,04 отчетливо наблюдался эффект реабсорбции. Устранение полного внутреннего отражения уменьшало эффект лишь вдвое. Наилучший эффект был получен при ограничении поперечных размеров возбуждающего пучка. В этом случае наблюдали десятикратное уменьшение вклада реабсорбции, практически пропорциональное уменьшению площади возбуждения. Это явление можно объяснить объемной реабсорбцией флуоресценции, распространяющейся вдоль поглощающего слоя (в направлении перпендикулярном возбуждающему пучку). С уменьшением толщины слоя возрастает роль реабсорбции за счёт полного внутреннего отражения.
Контрольные вопросы
1. Что называют спектрофотометрией?
2. Как проводят определение коэффициента направленного пропускания и отражения?
3. Опишите работу интегрирующих фотометрических шаров.
4. Что входит в состав спектрофотометра?
5. Что необходимо учитывать при корректном определении оптической плотности и прозрачности среды?
6. В чём заключается отличие флуоресцентной спектроскопии от других спектральных методик?
7. Из каких основных элементов состоит спектрофлуориметр?
8. В чём заключается эффект внутреннего фильтра?
9. Что такое вторичное поглощение в флуоресцентном анализе объекта?
|
ATP/ATR СПЕКТРОМЕТР 
О КОМПАНИИ